La película cuenta con un reparto diverso y talentoso que da vida a una variedad de personajes. Además de Shameik Moore como Miles Morales, la película presenta a Hailee Steinfeld como Gwen Stacy (Spider-Gwen), Mahershala Ali como Prowler, y Zoe Kravitz como Spider-Woman, entre otros. Cada personaje aporta su propia personalidad y habilidades únicas a la historia, enriqueciendo la narrativa y ofreciendo algo para todos los gustos.